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細(xì)胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重。實(shí)驗(yàn)君的很多成果可謂是成也細(xì)胞培養(yǎng)，敗也細(xì)胞培養(yǎng)。然而細(xì)胞虐我千百遍，我待細(xì)胞如初戀！科研人是不會這么被輕易打敗的。各大平臺上討論細(xì)胞培養(yǎng)的帖子不勝枚舉，百家爭辨。本文收集整理了相關(guān)書籍以及行業(yè)平臺關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)，希望對大家有所幫助。
一、新買或惠贈的細(xì)胞
1.新買的或惠贈的細(xì)胞如何處理？
不管買的細(xì)胞、惠贈的細(xì)胞，剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂；培養(yǎng)基是否漏出，是否渾濁；是否有支原體污染；迅速擴(kuò)增凍存。
2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
3.購買的細(xì)胞死亡或存活率不佳可能原因？
常見原因可能有：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳；血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳；解凍過程錯誤；冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心；懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤；培養(yǎng)箱氣體濃度達(dá)不到要求；細(xì)胞置于 –80 ℃ 太久。
二、復(fù)蘇凍存的細(xì)胞
4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落的原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí)，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。
5.冷凍管應(yīng)如何解凍？
將冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)，必須注意安全，可佩戴防護(hù)眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。
6.細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除 DMSO？
現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會在解凍細(xì)胞后加培養(yǎng)液將DMSO出去，但也有研究者認(rèn)為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題。
三、細(xì)胞培養(yǎng)用液
7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類？
引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：
8.如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長?？傊?，選 MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)，RPMI-1640 做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)應(yīng)選 AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。
9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。
10.細(xì)胞培養(yǎng)基的配制和儲存應(yīng)該注意什么？
細(xì)胞培養(yǎng)基配好后，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h，已檢測培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實(shí)驗(yàn)。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個(gè)批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清，這樣實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，配液時(shí)調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜，一次配液不要太多，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補(bǔ)充，二是量大易造成污染。
11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色？
培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)，可以通入無菌過濾 CO2，以調(diào)整 pH 值。
12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基？
對于應(yīng)用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分離制備細(xì)胞生長因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無血清培養(yǎng)基。
13.如何選擇正確的血清種類？
14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。
15.血清滅活是否必須？
這個(gè)問題現(xiàn)在有爭議。有人主張價(jià)格不菲的血清中含有諸如生長因子，維生素，氨基酸等珍貴物質(zhì)，而將它們置于50℃以上的溫度長達(dá)30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子，氨基酸等成分帶來的負(fù)面影響。盡管如此，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，尤其是在昆蟲細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中。
16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？
除特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
17.何時(shí)更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
四、細(xì)胞傳代
18.細(xì)胞傳代的方法都有哪些？
根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長的細(xì)胞用消化法傳代；部分貼壁生長的細(xì)胞用直接吹打即可傳代；懸浮生長的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打。
19.原代培養(yǎng)的傳代應(yīng)注意的問題？
細(xì)胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代；原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長，不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理，并根據(jù)不同細(xì)胞對胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞；
吹打細(xì)胞時(shí)動作要輕巧盡可能減少對細(xì)胞的損傷；傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些，使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。
20.使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的？應(yīng)如何處理？
EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞*分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA，在終止消化前，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低，并可減少污染的機(jī)會。
21.欲將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
欲回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為800~1000 rpm，5~10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
22.細(xì)胞的接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的重要原因之一。
23.細(xì)胞交叉污染的可能原因？
多種細(xì)胞系進(jìn)行維持傳代操作時(shí)，各細(xì)胞系所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。
五、細(xì)胞凍存
24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO？
因?yàn)榧?xì)胞在不加任何保護(hù)劑的情況下直接凍存時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將造成細(xì)胞損傷，還可引起細(xì)胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護(hù)劑。這兩種細(xì)胞無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞，可以使冰點(diǎn)下降，提高包膜對水的通透性。
25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？
冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO，其本身即為無菌狀況，次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會。若要過濾 DMSO，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質(zhì)濾膜。
26.欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。
27.冷凍保存細(xì)胞的方法？
冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存。
冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。–20 ℃ 不可超過 1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中，存活率稍微降低一些。
28.細(xì)胞凍存太多會不會浪費(fèi)？
每一種細(xì)胞系都應(yīng)有充足的凍存儲備，防止由于細(xì)胞污染等因素造成的細(xì)胞系的絕種，而且每一批次培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)都不同，應(yīng)該挑選幾個(gè)狀態(tài)較好的批次凍存保種。另外二倍體細(xì)胞等有限細(xì)胞系如果暫時(shí)不用應(yīng)凍存以免傳代太多，造成細(xì)胞衰老或者發(fā)生改變。
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