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從17世紀(jì)開(kāi)始，現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展就與顯微成像技術(shù)緊密相關(guān)。然而，由于受光學(xué)衍射極限的影響，傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像分辨率小約為入射光波長(zhǎng)的一半。因此，科學(xué)家們一直在不斷努力，試圖尋找突破光學(xué)顯微鏡分辨極限的方法。
在超分辨顯微技術(shù)飛速發(fā)展的同時(shí)，現(xiàn)有成像技術(shù)的缺陷也日益顯現(xiàn)，例如成像分辨率和成像時(shí)間不可兼得;對(duì)透鏡制造技術(shù)提出了一定要求的同時(shí)，也限制了觀測(cè)的視野;日益復(fù)雜的設(shè)備使得操作和維護(hù)也越來(lái)越困難……為了解決上述問(wèn)題,需要發(fā)展一些新型的超分辨技術(shù)以適應(yīng)不同領(lǐng)域的要求。
表面增強(qiáng)超分辨技術(shù)
現(xiàn)有超分辨技術(shù)在樣品縱向圖像的獲取上可分為兩類：
1. 通過(guò)增加可獲取的信號(hào)縱深以更好地獲取樣品的三維圖像，如雙光子熒光顯微技術(shù)等;
2.通過(guò)降低可獲取的信號(hào)縱深以更好地獲取樣品表面的圖像，如等離子結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(PSIM)和基于芯片的寬視場(chǎng)納米顯微術(shù)(CWN)等。
下面主要介紹第2類技術(shù)中的兩種新型前沿顯微技術(shù)，二者都是利用特殊材料的樣品作為載物臺(tái)對(duì)照明光進(jìn)行有效的調(diào)制，以增強(qiáng)樣品表面的成像效果。
等離子結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)
PSIM是于2014年由WeiFF等在傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)光照明顯微(SIM)原理的基礎(chǔ)上利用表面等離子體干涉(SPI)代替光學(xué)干涉，從而獲得達(dá)到SIM兩倍分辨率的新型超分辨顯微技術(shù)，該技術(shù)的關(guān)鍵在于對(duì)表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的應(yīng)用。
近年來(lái)，SIM由于其光毒性低、成像速度快、適用于觀察活細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，然而傳統(tǒng)SIM由于原理上的限制只能達(dá)到衍射極限兩倍左右的成像分辨率。PSIM將SIM與可調(diào)制的SPI結(jié)合起來(lái)，用SPI序列作為新的照明光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)SIM中的激光干涉條紋，利用振鏡掃描實(shí)現(xiàn)條紋變化，通過(guò)重建達(dá)到了相當(dāng)于傳統(tǒng)SIM兩倍的分辨率。
圖1 PSIM技術(shù)下的直徑為100 nm的熒光顆粒。(a)傳統(tǒng)的熒光顯微;(b)重建的PSIM圖像;(c)對(duì)應(yīng)的SEM圖像;(d-e)a，b兩圖的傅里葉變換，黃色虛線代表光學(xué)傳遞函數(shù)。(f)藍(lán)色的為傳統(tǒng)熒光成像的截面強(qiáng)度分布，綠色和紅色為PSIM重建后的兩個(gè)軸向分布
相比之下，PSIM主要有以下優(yōu)點(diǎn)：
1.高分辨率。與傳統(tǒng)SIM技術(shù)和SSIM技術(shù)相比，PSIM的優(yōu)勢(shì)在于在不減幀速且不利用飽和熒光效應(yīng)的前提下獲得高分辨率的顯微圖像。
2.高信噪比。倏逝波在垂直方向上快速衰減,通過(guò)將激發(fā)光限制在樣品表面一個(gè)很小的區(qū)域內(nèi)即可得到較高的信噪比。
3.成像分辨率不依賴于NA。PSIM原理上不依賴于NA的限制,利用較小NA的物鏡仍可獲得比SIM更高分辨率的圖像。
4.極大的應(yīng)用前景。對(duì)于諸如哺乳動(dòng)物細(xì)胞等需要對(duì)其表面進(jìn)行觀測(cè)的樣品，PSIM是一種能夠較好地解決衍射極限問(wèn)題、同時(shí)還具備較高對(duì)比度的成像手段。這種技術(shù)將在高速超分辨領(lǐng)域內(nèi)產(chǎn)生巨大的影響。
芯片照明超分辨
基于芯片的CWN，簡(jiǎn)稱芯片照明超分辨，利用照明光在波導(dǎo)片與樣品界面處產(chǎn)生的瞬逝場(chǎng)使得樣品僅在表面極薄的部分得到激發(fā)，從而減弱獲取信號(hào)中背景信息的干擾，實(shí)現(xiàn)超分辨。
CWN技術(shù)是由Grandin等在2006年提出的，并由Diekmann等在2017年進(jìn)行改進(jìn)。Diekmann等利用波導(dǎo)片實(shí)現(xiàn)了照明光與探測(cè)光的*分離，在原有的平板波導(dǎo)的基礎(chǔ)上研制了可控能力更強(qiáng)的肋形波導(dǎo)和帶狀波導(dǎo)，如圖2所示,將復(fù)雜的光學(xué)功能集成在以波導(dǎo)片為主體的通用平臺(tái)上。
圖2 波導(dǎo)片a.在原有平板波導(dǎo)的基礎(chǔ)上部分蝕刻可制成肋形波導(dǎo);b.在原有平板波導(dǎo)的基礎(chǔ)上*蝕刻至SiO2底板可制成帶狀波導(dǎo)。兩種情形下波導(dǎo)通道的寬度都是25-500 μm
CWN的主要優(yōu)點(diǎn)有：
1.波導(dǎo)片的應(yīng)用將激發(fā)光路*從顯微系統(tǒng)中分離出去，使用時(shí)無(wú)需考慮光路的耦合，大大降低了整套設(shè)備的復(fù)雜度;
2.波導(dǎo)片利用光在高折射率材料和周圍介質(zhì)(水或細(xì)胞)間的界面上發(fā)生全內(nèi)反射的原理，地利用瞬逝場(chǎng)照明樣品;
3.由于其對(duì)照明光在空間上的嚴(yán)格限制，圖像具有較高的信噪比;
4.由于照明光與成像光的物鏡非相關(guān)，因此可以隨意根據(jù)需要更換不同放大倍數(shù)/分辨率的物鏡;
5.由于該技術(shù)對(duì)光信號(hào)的利用效率高，使用NA較小的物鏡即可在獲得較大視場(chǎng)的同時(shí)，確保圖像的分辨率不至于太差。
Diekmann等利用兩種互補(bǔ)的技術(shù)———ESI技術(shù)和直接STORM(dSTORM)技術(shù)，展現(xiàn)了基于波導(dǎo)芯片的超分辨熒光顯微成像技術(shù)的功能。這項(xiàng)技術(shù)解決了一直以來(lái)存在于超分辨顯微技術(shù)中的缺陷,提高了超分辨顯微系統(tǒng)的應(yīng)用性能，有極大的市場(chǎng)價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。此外，該技術(shù)為研究者提供了新的思路，基于芯片的激光產(chǎn)生、過(guò)濾和調(diào)制技術(shù)將為超分辨顯微領(lǐng)域帶來(lái)發(fā)展的新動(dòng)力?？梢灶A(yù)見(jiàn)，未來(lái)的超分辨顯微領(lǐng)域?qū)?huì)因?yàn)楣庾蛹呻娐返陌l(fā)展而再次產(chǎn)生較大的飛躍。
偏振超分辨成像技術(shù)
熒光的基本物理尺寸包括強(qiáng)度(反映熒光濃度)、波長(zhǎng)(吸收和發(fā)射光譜)、時(shí)間(熒光衰減壽命)和偏振(由偶極子取向產(chǎn)生)。想比于其他三個(gè)維度，偏振在超分辨領(lǐng)域的發(fā)展仍處于初級(jí)階段。
2014年，Walla課題組提出了偏振調(diào)制超分辨(SPoD)技術(shù)。該技術(shù)在不需要結(jié)構(gòu)光照明、開(kāi)關(guān)調(diào)制以及閃爍熒光探針的條件下通過(guò)偏振調(diào)制以及偏振角度縮小實(shí)現(xiàn)了超分辨成像，將偏振引入超分辨顯微成像領(lǐng)域。偏振調(diào)制數(shù)據(jù)采用SPEED反卷積算法進(jìn)行解調(diào)，從而重構(gòu)超分辨圖像。該方法雖然可以實(shí)現(xiàn)超分辨，但重構(gòu)期間會(huì)導(dǎo)致偶極子方向信息丟失。
2016年10月31日，北京大學(xué)課題組及其合作者提出了一種新的基于偏振偶極子方位角的SDOM技術(shù)。該技術(shù)利用稀疏增強(qiáng)反卷積算法代替了SPEED算法，同時(shí)從熒光強(qiáng)度和熒光各向異性等方面來(lái)考慮偏振調(diào)制能否帶來(lái)更多超分辨信息，回答了上述爭(zhēng)論問(wèn)題，并在實(shí)現(xiàn)相同強(qiáng)度分辨率的條件下進(jìn)一步獲取了偶極子取向信息。
另一種偏振超分辨技術(shù)主要基于單分子成像。Cruz等提出的偏振解析dSTORM(polar-dSTORM)可在一幀中測(cè)量單個(gè)熒光偶極子，并通過(guò)隨機(jī)切換開(kāi)/關(guān)狀態(tài)在其他幀中測(cè)量其他的偶極子取向，再通過(guò)重建獲得整體的超分辨率圖像。在polar-dSTORM中，為了保持單分子定位中的高信噪比，使用兩個(gè)探測(cè)通道來(lái)實(shí)現(xiàn)平面取向內(nèi)偶極子取向信息的測(cè)量，并忽略單個(gè)偶極子的擺動(dòng)信息。通過(guò)重建算法計(jì)算每幀中單個(gè)分子的方位角和位置，可以實(shí)現(xiàn)單分子的準(zhǔn)確定位和取向測(cè)量。
相比于其他超分辨技術(shù)，利用偏振實(shí)現(xiàn)超分辨的優(yōu)勢(shì)在于：在不犧牲成像速度和樣品毒性的前提下獲取樣品的超分辨信息;可在不影響原系統(tǒng)性能的條件下很容易與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)相結(jié)合使用。因此，未來(lái)熒光偏振超分辨顯微鏡可在更多的生物領(lǐng)域中發(fā)揮作用。
還有一種不依賴于光學(xué)技術(shù)來(lái)突破衍射極限的方法，該方法是在衍射極限存在的條件下人為地放大生物樣品，從而觀察到更細(xì)微的結(jié)構(gòu)信息。這便是我們接下來(lái)要講述的利用化學(xué)方法將樣品物理放大的膨脹樣品超分辨成像技術(shù)。
膨脹樣品超分辨成像技術(shù)
膨脹樣品顯微術(shù)(ExM)的概念是由Chen等于2015年提出的，該技術(shù)利用高吸水性分子吸水溶脹的特性，將樣品物理放大以達(dá)到超分辨顯微的效果。這種高吸水性分子常見(jiàn)的用途之一就是嬰兒尿布。我們知道在吹氣球的時(shí)候，氣球吹得越大，氣球的厚度越薄，也就是說(shuō)，我們想要讓樣本放得更大，就需要減少細(xì)胞中那個(gè)由高吸水性分子形成的網(wǎng)的密度，如此一來(lái)大的問(wèn)題便是細(xì)胞在溶脹過(guò)程中無(wú)法各向同性的擴(kuò)大，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得極其不穩(wěn)定，也就沒(méi)有了觀察的意義。
如何將一個(gè)樣品在高度放大的同時(shí)保留其原有結(jié)構(gòu)呢?
研究人員通過(guò)努力找到一種方法使得細(xì)胞在溶脹的過(guò)程中還可以保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而這種方法便是采用另一種高吸水性分子凝膠。在樣本隨著吸水分子的膨脹倍增之后，讓凝膠去破壞原有吸水分子間的交聯(lián)以保持樣品結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，隨后再次讓樣本膨脹，進(jìn)一步放大它的尺寸。如此一來(lái)，樣本可放大到20倍左右，分辨率達(dá)到25 nm。
ExM便宜、快速且分辨率高，在超分辨顯微成像中已是一個(gè)巨大的突破，可實(shí)現(xiàn)常規(guī)超分辨光學(xué)顯微鏡可達(dá)到的效果。相比于傳統(tǒng)顯微鏡，ExM的時(shí)間分辨率無(wú)附加限制，但空間分辨率可以達(dá)到25 nm。相比于原有超分辨技術(shù)，其樣品制備要求與傳統(tǒng)顯微鏡相同,因而適用范圍較廣。
表 幾種新型成像方法對(duì)比
上述幾種新型的超分辨技術(shù)在不同的應(yīng)用中各有所長(zhǎng)，為光學(xué)成像領(lǐng)域帶來(lái)了新的曙光。隨著人們對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域的不斷深入探索，超分辨技術(shù)將會(huì)繼續(xù)發(fā)展以滿足不同的應(yīng)用需求。
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